Pruebas y Tecnicas

Aviso: Ante cualquier duda o necesidad de aclaración sobre las técnicas, por favor deja tu comentario al final de esta pagina.


LAVADO DE HEMATÍES

1. Para preparar una suspensión de hematíes al 5%: un volumen de 500 microlitros que es la cantidad suficiente para realizar la determinación del grupo ABO e incluso Rh, ya que tan solo se utilizan 50 microlitros por reactivo hemoclasificador y son cinco reactivos.

Ej: si necesito preparar una suspensión total de 500 ul (Hematíes + SSFF)usando la regla de tres simple seria asi:

 500ul         100%

                                    

          X        5%

      

X = 5 x 500 / 100  por tanto  X = 2500 / 100 resultado X = 25

  

X = 25 ul de hematíes a los que adicionaríamos 475 ul de Solución salina Tamponada o simplemente Solución Salina Fisiológica Estéril.

2. En un tubo de ensayo colocamos 50 ul de hematíes, llenando las 3/4 partes del tubo de ensayo con SSFE (Solución Salina Fisiológica Estéril) tamponada a pH 7,2 +/- 0,2 , Proceder a realizar de dos a tres lavados de 3 minutos a 3.500 r.p.m.

3. Después del último lavado, en el que se debe eliminar al máximo la solución salina mediante una maniobra de volcar los tubos sobre papel absorbente.

4. Al botón de hematíes ya lavados dispensar 475 ul de SSFE (Solución Salina Fisiológica Estéril) tamponada a pH 7,2 +/- 0,2.


GRUPO SANGUÍNEO ABO/RH Y GRUPO SANGUÍNEO INVERSO

1. Una vez que se han preparado las suspensiones celulares correctas se debe preparar para cada muestra la siguiente batería de tubos de ensayo rotulándolos de la siguiente manera:

La siguiente tabla intenta explicar el manejo y la utilidad de cada uno de los tubos de ensayo y las reacciones que tienen lugar en cada caso:

En el caso de clasificación para recién nacidos solo se debe realizar la clasificación globular que incluye los 3 primeros reactivos (Anti-A, Anti-B y Anti-AB), fue mencionado previamente las isoaglutininas de grupo sanguíneo podrían tardar 3-6 meses e incluso un año en ser producidos por el niño y al realizar la prueba inversa se podría estar detectando los anticuerpos maternos llevando a una confusión más bien que a una resolución de la hemoclasificación, en casos de dudas. Sugiero en este punto, realizar para los recién nacidos un Test de Coombs Directo para descartar cualquier tipo de sensibilización de los hematíes.

2. Grupo sanguineo, Toda vez que se han transferido 50 microlitros de las suspensiones de Hematíes al 5%  a los tubos marcados Anti-A, Anti-B, Anti-AB, Anti-D, Rhesus Control y 50 microlitros (una gota dispensada con el gotero correspondiente de cada reactivo comercial al tubo que corresponda), se debe mezclar los tubos ligeramente y proceder a colocarlos de manera equilibrada en la centrifuga incluyendo el tubo de auto control del donante o paciente según sea el caso incluyendo el suero y glóbulos rojos propios.

3. Grupo sanguineo Inverso, En los tubos marcados como células alfa, células beta y células O, se deben dispensar 100 uL del suero del donante o del paciente en quien se está investigando el grupo sanguíneo y posteriormente dispensar una gota de células de fenotipo conocido A al tubo alfa, una gota de células de fenotipo conocido B al tubo beta y una gota de células O al tubo, se debe mezclar los tubos ligeramente y proceder a colocarlos de manera equilibrada en la centrifuga.

                       Reactivos                 Células Pool A, B y O (Ver Anexo I)

4. Proceder a centrifugar según el tiempo y revoluciones por minuto establecidas por el fabricante y que deberán estar bien descritas en el inserto. Una alternativa serían a 1000 r.p.m. durante un minuto.

5. Observar siempre con ayuda de la luz de un aglutinoscopio la presencia de aglutinación o hemólisis, y registrar los resultados obtenidos.

PRUEBA CRUZADA LADO MAYOR

Se debe tomar en cuenta que la prueba cruzada incluye tres fases y que la ejecución de todas forma parte de un conjunto de pasos que no pueden ser separados.

Es inapropiado considerar la parte inicial donde se testan los glóbulos rojos con suero/plasma como prueba cruzada y la adición del reactivo de Coombs como otra prueba.

El no llegar hasta la Fase Antiglobulínica que implica la adición del reactivo de Coombs tiene el mismo sentido que el no haber realizado la prueba de compatibilidad, y no debería ser considerada efectuada si es que no culmina con la adición del mismo, a no ser que en la primera fase ya hubiera incompatibilidad evidente, momento en el cual ya se toma la decisión de seleccionar otra unidad para comenzar otra prueba cruzada.

Lo correcto es considerar la prueba como un procedimiento que se desarrolla en tres fases:

* FASE I SALINA INMEDIATA

1. Rotular un tubo de ensayo, uno con la denominación M y el número de la unidad que está siendo testada y el segundo ya fue rotulado previamente con la denominación AC y las iniciales o nombre del receptor.

2. Dispensar en ambos tubos 100 uL del suero del receptor

3. Dispensar en el tubo marcado M 50 uL de la suspensión al 5% de los hematíes preparados a partir de la tubuladura de la unidad a transfundir

4. En el tubo AUTOCONTROL dispensar 50 uL de los propios hematíes del receptor.

5. Centrifugar inmediatamente a 1000 r.p.m. durante un minuto y proceder a la lectura  con ayuda de la fuente de luz del rhesuscopio, no debe existir aglutinación, en caso de ser positiva, implicaría incompatibilidad del sistema ABO, o la presencia de anticuerpos en el suero del receptor que no hubieran sido demostrados en la prueba de detección de anticuerpos irregulares (probablemente el antígeno correspondiente no estaba presente en las células utilizadas como PANEL DETECTOR DE ANTICUERPOS IRREGULARES).

En este caso inmediatamente se procede a seleccionar otra unidad para empezar nuevamente todo el procedimiento de prueba cruzada.

6. En caso de que no exista ninguna evidencia de aglutinación y la unidad presumiblemente sea compatible hasta este momento, se continúa con la fase siguiente:

* FASE II POTENCIADOR DE REACCIÓN/TÉRMICA

1. En esta fase se deberán utilizar como mínimo un potenciador de reacción, siendo los ideales para los Servicios de Transfusión la Albumina Sérica Bovina al 22% (ASB) y Solución LISS.

2. Por tanto en este caso, si se contara con ASB 22% se deberán dispensar dos gotas del reactivo directamente del frasco que cuenta con gotero tanto al tubo de ensayo marcado como “M ALBUMINA” como al tubo AUTOCONTROL y proceder a incubar en

Estufa de Incubación a 37°C (cubriendo la parte superior del tubo con papel parafinado) o en Baño María a 37°C durante 20 minutos (a no ser que el fabricante del reactivo ABS

22% indicara alguna variación a este tiempo).

3. Si se pudieran utilizar dos potenciadores de reacción - que idealmente es la manera correcta de proceder - preparar una suspensión de los hematíes procedentes de la tubuladura al 5% en LISS, este procedimiento implica dispensar 10 uL de los hematíes de la unidad (tubuladura) y 200 uL de solución LISS (4 gotas en caso de que el reactivo disponible tenga la presentación de frasco gotero).

4. Acto seguido en un tubo rotulado como M, el número de la unidad y la letra “L” de LISS, se dispensan 50 uL de dicha suspensión de hematíes (preparada según lo indica el inciso c) y 100 uL del suero del receptor y se procede a incubar en Estufa de Incubación a 37°C (cubriendo la parte superior del tubo con papel parafinado) o en Baño María a 37°C durante 10 minutos (a no ser que el fabricante de SOLUCION LISS indicara alguna variación a este tiempo).

Al tubo denominado AUTOCONTROL dispensar dos gotas de la solución LISS y proceder de igual manera con el mismo tiempo de incubación que el tubo M LISS.

En caso de que se estén utilizando simultáneamente ambos potenciadores de reacción, se deberá seleccionar por un tema de costo, utilizar ASB 22% como potenciador para el tubo AUTOCONTROL o únicamente solución LISS.

5. Culminado el tiempo de incubación, centrifugar inmediatamente a 1000 r.p.m. durante un minuto y proceder a la lectura con ayuda de la fuente de luz del rhesuscopio, no debe existir aglutinación, en caso de ser positiva o positiva muy débil, implicaría incompatibilidad, y habría que seleccionar otra unidad y empezar el procedimiento nuevamente. Siendo negativa la presencia de aglutinación, y presumiblemente compatible la unidad hasta este momento, se procede con la siguiente fase de la prueba.

* FASE III FASE ANTIGLOBULÍNICA

1. Proceder a realizar tres lavados de 3 minutos a 3.500 r.p.m., llenado las 3/4 partes de cada tubo de ensayo con SSFE tamponada a pH 7,2 +/- 0,2 o con SSFE.

Durante los lavados se puede utilizar pipetas Pasteur descartables para eliminar al máximo posible la solución de lavado, y verter el contenido en frascos contenedores para Inactivación de Residuos Patógenos que contengan Hipoclorito de Sodio al 0,5%.

2. Después del último lavado, en el que se debe eliminar al máximo la solución salina mediante una maniobra de volcar los tubos sobre papel absorbente, dispensar 2 gotas del reactivo de Coombs a los tubos de ensayo que podrán ser uno o dos según se utilizó uno o dos potenciadores de reacción y al tubo AUTOCONTROL para luego centrifugar un minuto a 1000 r.p.m.

3. Proceder a la lectura con ayuda de la fuente luz del rhesuscopio; no debe existir aglutinación, en este caso la unidad sería COMPATIBLE, el tubo AUTOCONTROL tampoco deberá presentar evidencia de aglutinación, sin embargo para realizar la aseveración final en cuanto a la compatibilidad se debe continuar con el siguiente paso.

4. Finalmente para corroborar que el procedimiento se realizó de manera correcta, se deben dispensar 50 uL de las Células Control de Coombs (CCC) que se preparan regularmente en cada Servicio de Sangre (Ver Anexo IV).

5. Centrifugar inmediatamente a 1000 r.p.m. durante un minuto y proceder a la lectura con ayuda de la fuente luz del rhesuscopio.

Las células rojas reactivas CCC, se emplean en Bancos de Sangre y Servicios de Transfusión como control analítico ante un resultado negativo de la fase Antiglobulínica, el resultado, debe ser positivo después de la adición de las células control de Coombs. Estas células “control” permiten asegurar que el procedimiento se ha realizado correctamente ya que si las células control de Coombs no tornan la reacción positiva, la prueba no es válida, pues significaría que cuando se realizó la fase Antiglobulínica y se añadió el reactivo de Coombs, había reactivo fijado a las células lo que sería indicio de aglutinación e incompatibilidad.

Así también dentro de las posibles causas de este resultado, podrían citarse el no haber añadido el suero AHG a los tubos, el lavado inadecuado de las células o el deterioro del reactivo de AHG, entre otras.⁽¹⁵⁾ Es por ello que la utilización de estas células en las pruebas de laboratorio que empleen el suero de Coombs como reactivo principal son requeridas en los estándares para bancos de sangre y Servicios de Transfusión de la Asociación Americana de Bancos de Sangre (AABB), por constituir un sistema de control analítico ante un resultado negativo de la prueba de antiglobulina humana.

Por tanto; si existiera aglutinación al final de la adición de las CCC cuando el resultado en la Fase Antiglobulínica fue negativa, se concluye que la unidad es COMPATIBLE con el receptor.

En caso de que al final de la Fase Antiglobulínica, ésta fue positiva se concluye que: la unidad es INCOMPATIBLE con el receptor y se debe proceder a seleccionar otra unidad y comenzar nuevamente la prueba cruzada. (Aunque pudiera sobre entenderse, se menciona que cuando el resultado evidencia aglutinación, ya no es necesario añadir las CCC).